冷冻电镜工作原理是怎样的?( 二 ) _是怎样

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3. 冷冻电子断层扫描技术电子断层成像通过获取同一区域多个角度的投影图来反向重构所研究对象的三维结构，适合于在纳米级尺度上研究不具有结构均一性的蛋白、病毒、细胞器以及它们之间组成的复合体的三维结构。虽然目前电子断层成像所获得的结构的分辨率(约4～10 nm)，但其在研究非定形、不对称和不具全同性的生物样品的三维结构和功能中有着不可替代的重要作用。冷冻电子断层成像的适用尺度非常广泛，包括从分子水平的蛋白质，到亚细胞水平的细胞器，以至细胞水平的组织结构。它有效地填补了X- 射线晶体学、核磁共振以及冷冻电镜单颗粒分析等方法得到的高精度结构和光学显微镜技术得到的低分辨率的细胞整体图像之间的空白。

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4. 冷冻电镜单颗粒技术冷冻电镜单颗粒技术利用大量二维投影图像的数据，结合蛋白复合物在不同方向上的相同副本，对结构进行三维重建。和大多数其他低温电子显微镜应用一样，单粒子成像的第一步是将可溶复合物扩散到碳膜的孔上。然后标本被柱塞冷冻，形成一层薄薄的玻璃态冰，理想情况下，这层冰中含有不同方向的复合物的相同副本。冰层的厚度可能从几百埃到几千埃不等，受粒子的尺寸和缓冲区的组成的影响。从含有许多分子复合物的场的图像开始，通过人工或自动算法选择单个粒子。一旦选择统计方法，如主成分分析、多变量分析或协方差分析，可用于根据图像结构特征的变化对其进行排序。从分子复合体的二维电子显微镜投影视图生成三维重建依赖于所有粒子的相对方向。所涉及的步骤在数学上是复杂的，并利用了中心投影定理，该定理指出，对于一个三维对象，每个二维投影的傅里叶变换是通过该对象的三维傅里叶变换得到的一个中心切片(图5) 。因此,通过获得数量足够大包含相对于电子束各种各样的方向的分子图像,可以建立3D图像(如图6所示,显示2D图像不同取向的GroEL用于获得其三维结构) 。

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5. 冷冻电子显微镜技术的突破【冷冻电镜工作原理是怎样的?】在最近几年，冷冻电镜技术的突破主要体现在三个方面。首先是样品制备，通过利用薄膜碳层甚至石墨烯可以用更薄的冰层包裹分子样品来提高信噪比。第二个突破是电子的探测技术，也就是电子探测器的发明。在300 keV 电子的轰击下，传统的器件都会被高能量打坏，因此在电子探测器出现之前，冷冻电镜中使用的CCD相机需要将电子打在探测器上变成光信号，再通过CCD 把光信号转成电信号后得到图像，“电光—光电”转换的过程降低了信噪比。而现在电子探测器能够直接探测电子数量，同时，互补型金属氧化物半导体(CMOS)感光元件的应用使得探测器支持电影模式(movie mode)，可以在一秒钟之内获得几十张投影图片。通过后期对样品进行漂移修正，再把这几十张图片叠加起来，从而大幅提高成像的信噪比。模糊的图像一下子变得清晰，冷冻电镜的分辨率不断上升。第三个突破是计算能力的提高和软件算法的进步。冷冻电镜的模型重构通常需要对几万甚至几十万张投影图片进行分析、组装和优化。这需要先进的计算资源配合有效的算法才能实现。综上所述，冷冻电镜技术不仅提高了空间分辨率，而且可以应用于很多以前不能解决的生物大分子的结构研究。